2018年10月5日，國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊《分子細(xì)胞》在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院（營(yíng)養(yǎng)與健康研究院）常興研究組題為“Genetic modulation of RNA splicing with a CRISPR-guided cytidine deaminase”的最新研究成果。證明可以利用TAM（Targeted-AID induced mutagenesis）基因編輯，靶向DNA上的RNA剪接順式元件，高效調(diào)控RNA剪接，用于研究RNA可變剪接的功能，以及用于人類(lèi)遺傳疾病的治療。
真核細(xì)胞中， RNA剪接是基因的表達(dá)的重要環(huán)節(jié)。據(jù)估計(jì)，超過(guò)75％的人類(lèi)基因具有一種以上的mRNA剪接方式 （可變剪接），其中大部分可以翻譯為功能性蛋白質(zhì)。但相對(duì)于基因功能而言，對(duì)于可變剪接的生理功能，認(rèn)識(shí)還非常有限，原因主要在于調(diào)控內(nèi)源RNA剪接的實(shí)驗(yàn)手段非常有限。RNA剪接的異常也是許多疾病的直接誘因，估計(jì)35~50％的人類(lèi)疾病由基因剪接異常造成。因此，無(wú)論是從學(xué)術(shù)研究或是臨床應(yīng)用的角度，都亟需開(kāi)發(fā)出調(diào)控RNA剪接的基因編輯新方法。
常興研究組過(guò)去開(kāi)發(fā)TAM（Targeted AID-induced mutagenesis），也就是融合核酸酶活性缺陷的Cas9蛋白和胞嘧啶脫氨酶AID，并且發(fā)現(xiàn)它具有兩個(gè)特點(diǎn)。首先，可以在sgRNA靶向的DNA上，將C/G堿基隨機(jī)向其它堿基突變，可以用于分析腫瘤耐藥性突變及誘導(dǎo)蛋白體外進(jìn)化等；其次，在偶聯(lián)UNG抑制劑UGI后，可以在將sgRNA靶向區(qū)域中一個(gè)小窗口內(nèi)（5-6個(gè)堿基）的C高效向T突變（Nature Methods 2016）。
在這一新研究中，博士研究生袁娟娟和馬云青首先注意到，98%以上的內(nèi)含子有保守的GU（內(nèi)含子開(kāi)始）和AG（內(nèi)含子末尾）序列，推測(cè)如果可以高效精確的將G突變成A, 可以特異性阻斷外顯子識(shí)別，調(diào)控內(nèi)源性mRNA的剪切。通過(guò)這一策略，利用TAM誘導(dǎo)剪接位點(diǎn)DNA上G>A突變，就可以誘導(dǎo)可變外顯子（alternative exon）及組成性外顯子（constitutive exon）的跳讀（Exon skipping）；改變可變剪接位點(diǎn)的選擇（Alternative splice site）；調(diào)節(jié)互斥外顯子的選擇（mutually exclusive exons）；誘導(dǎo)小的內(nèi)含子的包含（intron retention）。此外，如果通過(guò)TAM將３'剪接位點(diǎn)上游polypyrimidine track中包含的C向T突變，可以促進(jìn)下游外顯子的包含。因此，利用TAM可以成功的實(shí)現(xiàn)針對(duì)RNA剪接的“l(fā)oss of function”和”gain of function”調(diào)控。
最后，研究人員探索了利用TAM修復(fù)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）的可行性。DMD是一種致命的遺傳疾病（發(fā)病率男性中１/4000）。其發(fā)病原因在于，遺傳突變?cè)斐蒁ystrophin蛋白的完全缺失，引發(fā)肌肉萎縮和癱瘓，最終造成心臟或肺功能的衰竭。如果通過(guò)外顯子跳讀，能產(chǎn)生內(nèi)部截短的Dystrophin蛋白，可以達(dá)到對(duì)DMD的治療效果。因此研究人員構(gòu)建了DMD病人來(lái)源的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞, 此病人因?yàn)橥怙@子刪除造成Dystrophin蛋白的完全缺失。通過(guò)在剪接位點(diǎn)誘導(dǎo)G>A的突變，研究人員實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)外顯子的完全跳讀，在所有表達(dá)TAM的細(xì)胞中恢復(fù)了Dystrophin的蛋白表達(dá)，修復(fù)了心肌細(xì)胞的缺陷。
該研究得到了科技部、國(guó)家自然科學(xué)基金委、中國(guó)科學(xué)院先導(dǎo)計(jì)劃和上海市科委相關(guān)項(xiàng)目的資助。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.09.002
圖.TAM融合蛋白高效調(diào)控外顯子跳讀、互斥外顯子選擇、可變剪接位點(diǎn)選擇和內(nèi)含子包含
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